研究背景：

外泌体荧光标记是外泌体功能研究中的必要的技术，然而在实际操作中对于使用多少的外泌体、加入多少的荧光染料、以及最终标记的效率是多少，这些问题都是不清楚的，给操作人员带来了不少困扰。

本研究目的是使用不同剂量的荧光染料标记外泌体，通过纳米流式仪检测外泌体荧光效率以及染色后外泌体重新纯化后的荧光效率。

材料与仪器：

1. 细胞株：293T  (ATCC, CRL-3216)
2. 外泌体提取试剂盒（Umibio, UR52121）
3. 纳米流式检测仪 （NanoFCM, N30E）
4. 相关试剂：

外泌体专用无血清培养基 (Umibio，UR51102)；PKH67绿色荧光标记染料 (Umibio，UR52303)

实验方法：

1. 细胞培养：

293T细胞通过外泌体专用无血清培养基进行培养，收集细胞上清液，通过0.45 um滤器过滤处理。

1. 外泌体分离提取：

通过Umibio细胞上清液外泌体提取试剂盒的说明书进行操作，提取的外泌体通过纳米流式检测仪进行颗粒浓度和BCA方法进行蛋白浓度测定。

1. 外泌体荧光染料标记：

• 配制染料工作液：用Diluent  C试剂（染色试剂盒自带）稀释染料储存液，配制浓度为100 nM的染料工作液(PKH67)；
• 稀释染料工作液：按照2倍梯度通过Diluent  C稀释100 nM的染料工作液；
• 向各实验组中加入10 uL对应浓度的染料，混匀后取10 uL进行纳米流式检测；
• 在标记的外泌体样品中补加入1 mL的PBS,使用试剂盒再次提取外泌体以去除游离染料；
• 沉淀用100 ul PBS重悬，再次进行纳米流式检测。

1. 外泌体荧光效率检测：

纳米流式上机检测（具体SOP见宇玫博生物微信公众号）

实验结果：

1. 293T-Exosome检测：

   提取的外泌体通过BCA方法检测，外泌体总蛋白浓度为0.882 mg/mL; 通过纳米流式仪检测颗粒浓度为6.0E+10 particles/mL。

1. 外泌体荧光染料标记分组

Group 1：Exosome（ 0 ug）+染料（100 nM，10 uL）    染料终浓度：100 nM
Group 2：Exosome（10ug）+ 染料（100 nM, 10 uL）    染料终浓度：50 nM
Group 3：Exosome（10ug）+ 染料（50 nM,  10 uL）    染料终浓度：25 nM
Group 4：Exosome（10ug）+ 染料（25 nM,  10 uL）    染料终浓度：12.5 nM
Group 5：Exosome（10ug）+ 染料（12.5 nM , 10 uL）    染料终浓度：6.25 nM
Group 6：Exosome（10ug）+ 染料（6.25 nM,  10 uL）   染料终浓度：3.125 nM
Group 7：Exosome（10ug）+ 染料（3.125 nM,  10 uL）  染料终浓度：1.5625 nM
以ddH₂O作为对照组校准基线。

1. 外泌体荧光标记效率检测

3.1染色后外泌体颗粒浓度变化趋势：
   100nM纯染料组中未加入外泌体颗粒，其他各组中初始外泌体浓度为3E+10  particles/mL，均为20 uL体系。图2是染色后的外泌体的颗粒浓度变化曲线图，100nM纯染料组中检测到5.7E+10 particles/mL的颗粒物，超出初始外泌体浓度，推测该颗粒为染料聚集物。50nM组中有3.71E+10 particles/mL的颗粒物，也高于初始外泌体浓度，推测该组中染料剂量过量，存在染料聚集物。

  1.5625nM组和3.125nM组中颗粒浓度小于1E+10  particles/mL，推测染料中Diluent  C稀释液对外泌体有一定的影响作用，可能会破坏外泌体。 3.2 染色后荧光外泌体比例：
100nM和50nM两个纯染料组中染料过量，荧光颗粒比例分别为81%和71.2%，其他各组的荧光外泌体比例均在35%以下。
    
3.3 重新提取后荧光外泌体比例：

   通过针对染色的外泌体进行2次提取，以去除多余的染料，在染料过量组100nM和50nM组中，荧光比例由最初的81%和71.2%下降到11.5%和23.3%；染料低剂量组中的荧光比例变化差异不是非常大，其中25nM在前后两次检测时，荧光比例都在30%左右，相对稳定且荧光比例较高。
实验结论：

根据本次实验，可以得到一些初步结论：

1. 在低剂量染料作用下（染料不过量时，25nM以内），在外泌体溶液中加入染料以及做二次提纯外泌体，外泌体的荧光比例变化不大（<5%）；染料在此剂量范围内使用时，可以不用进行外泌体的二次提纯操作，减少外泌体的损失；
2. 在高剂量染料作用下（染料过量时， 50nM以上），在外泌体溶液中加入染料以及做二次离心提纯外泌体，外泌体的荧光比例变化显著（>40%）；染料在此剂量范围内使用时，必须进行外泌体的二次提纯操作，减少染料对于后期实验的影响；
3. 在本次测试中25nM组，荧光效率较高，二次提取前后的变化不大，推荐染料使用浓度在20nM-25nM之间。

补充数据：
外泌体与细胞共孵育实验
25nM PKH67标记293T-Exosome后，与A549细胞共孵育2小时后，进行共聚焦观察；
 
参考文献：

1. Wenhao Dai, et al. Exosomes-mediated synthetic dicer substrates delivery for intracellular dicer imaging detection. 2019, Biosensors and Bioelectronics
2. Zhe Liu, et al. Monophosphoryl lipid A alleviated radiation‐induced testicular injury through TLR4‐dependent exosomes. 2020, JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR MEDICINE
3. Shin-ichiro Ohno, et al. Systemically Injected Exosomes Targeted to EGFR Deliver Antitumor MicroRNA to Breast Cancer Cells. 2012, The American Society of Gene & Cell Therapy
4. Hui Zhao, et al. Exosomes From Adipose-Derived Stem Cells Attenuate Adipose Inflammation and Obesity Through Polarizing M2 Macrophages and Beiging in White Adipose Tissue.2018,Diabetes
5. Ye Tian, et al. Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry. 2018, ACS Nano
6. Peng Lv, et al. Genetically Engineered Cell Membrane Nanovesicles for Oncolytic Adenovirus Delivery: A Versatile Platform for Cancer Virotherapy. 2019, Nano Letters

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