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上海宇玫博生物科技有限公司
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TEM 操作图解：一文读懂外泌体鉴定，学霸入门必备
人阅读 发布时间：2024-04-29 18:28
TEM 透射电镜是外泌体鉴定的金标准，对于所有做外泌体的朋友们来说，是必经之路，基于很多老师们的呼声，我们的研究人员，经过细致化整理，把所有的操作过程都整理出来，供各位参考，经验有限，有不当之处，还请多多沟通。
一、首先，我们看看电镜的原理是啥？
然后，电镜的结构也是比较复杂的！
二、那么，我们看看样品有哪些要求？
样品要求：
1、能被电子束穿透（薄）
2、耐电子束轰击
3、有磁性的样品不可以放置
4、长纤维样品若需上样需加盖铜网
三、接下来，我们看看规范化拍摄 Umibio 是怎么操作的？
声明：本次操作基于我司最近正在使用的 HT7700；
1、送样要求：样品尽可能浓，颗粒浓度 1.0E+10；
2、拍摄规范：样品以茶托状（有明显凹陷的）球形，椭球形或扁圆形，尺寸在 30-150nm，有双层膜结构的颗粒为目标进行拍摄；照片以轮廓清晰，分辨率高，焦距合适（既没有过焦的虚影，也没有欠焦的黑边），背景杂质少，明暗适宜，颗粒居中，整体美观为佳；
默认拍摄 100nm 一张，200nm 三张，500nm 一张；
注：铜网中样品焦距无法调清时以调试后的最佳结果拍摄，样品中无特征明显的颗粒或无颗粒时，拍摄 500nm 的样品颗粒物或制样“地形”三张；
命名：样品名-标尺-张数。
四、那么问题来了，我们是怎么制样的呢？
1、制样用品：培养皿，滤纸，碳膜铜网，无尘纸；计时器， 镊子，10μL 移液枪及枪头等；
1、制样用品：培养皿，滤纸，碳膜铜网，无尘纸；计时器， 镊子，10μL 移液枪及枪头等；
2、制样步骤：
1）滤纸铺在培养皿内，用镊子将通网正面朝上小心放置在滤纸上；
2）移液枪取 10μL 样液滴在铜网上，呈水滴状站立，计时 2min，使样本颗粒渗透，2min 后用针头将液滴挑开；
3）取 10μL 染液以同样方式滴在铜网上，染色 1.5min，染色结束后用针头将液滴挑开，用无尘纸将多余染液吸掉。
五、重点来了，电镜的详细操作步骤有哪些？
1、确认所有 COL 电源的按钮为 ON，启动 PC；
2、 左上角“operation”下，打开“加速电压/灯丝设定”窗口和“CCD 相机操作”窗口；
3、点击“HV on”加速电压上升，点击“Filam on”灯丝电压上升；
4、上样前操作-拔出样品杆
1）将样品杆顺进样轨道平行线向外拔，至有阻力拔不动时顺时针右转小角度(约 15°)，再次向外拔；
2）至有阻力拔不动时逆时针左转(约 45°)至样品杆上定位销完全移至定位销孔，样品仓红灯亮起；
3）将样品仓放气按钮向下拨至“Air”一侧，放气后灯灭，向外拔出样品杆。
5、上样中操作
5.1 将样品杆小心放在支架上，塑料把手在左，样品端在右；(样品杆银色不锈钢部分可以手碰，黄铜部分不可以用手触摸)
5.2 样品装入样品杆:
(1) 用小圆杆抵住样品杆前端小孔，按住往左推拉，另一只手用镊子夹住压片左端小角取出压片；
(2) 用镊子夹住样品对准样品杆前端小圆洞放入；
(3) 压片凹面朝上，圆洞对准样品杆上圆洞，两角抵住右端凹槽放在样品杆上；
(4) 用小圆杆抵住样品杆前端小孔，按住往左推拉，压片自然落下，松手后压片被抵住；
(5) 用洗耳球吹走灰尘；
6、上样后操作-插入样品杆
6.1 将样品杆按照定位销与销孔对应的方向插入至有阻力，将样品仓排气按钮向上拨至EVAC一侧，红灯亮；
6.2 等抽真空完成后，绿灯亮起，并伴随“滴---”的声音，紧接将样品杆小心顺时针右旋至有阻力时，微微逆时针左旋，再将样品杆完全送进样品仓，上样完成。
7、点击 “Beam on”：待左上角束流加至 10μA 左右时，可以开始调试参数寻找目标样品；
8、“LENS RESET”——初始化参数；
9、“BRIGHTNESS”键——调节亮度；移动轨迹球——调节视野；“MAGNIFICATION”键——调节放大倍数；
10、调节光圈；
11、调节样品高度；
12、目标样品寻找记录：
12.1 通过调节放大倍数，视野亮度和轨迹球找到目标样品并将其移动到视野中央；
12.2 调节“BRIGHTNESS”至亮度到-12，点击“RUN”, 进入放大模式；
12.3 左右旋转“FOCUS”调焦；
12.4 设置照片附带信息；
12.5 设置照片保存路径；
12.6 固定照片并保存；
12.7 点击“stop”退出拍照模式；
13、点击“Beam off”，结束拍照；
14、勾选并点击“RESET”，使镜头归位；
15、可以重新更换样品继续拍照，或取出样品结束拍照，结束后样品杆需放回样品仓内；
16、数据上传：在电镜旁边的电脑上按保存位置找到自己拍摄的照片，双击快捷方式打开数据上传客户端，将文件夹拖到页面中，输入自己的账户，等待数据上传结束。
17、关机
17.1 依次点击“Filam off”，“HV on”，关掉拍照和电压灯丝窗口；
17.2 数据传输电脑关闭后，将 COL 按钮按到“O”一侧，关闭仪器。
六、最后，我们看看有哪些常见问题吧！
1、视野飘逸，无法聚焦和固定照片
1）上样没有夹紧铜网；
2）电子束轰击，破坏碳膜；
3）上样/制样过程中铜网正反颠倒；
2、染色过深或过浅：染液：5% 磷钨酸溶液，PH 中，染色 1.5min；
3、照片不够清晰，对比度较弱
1）制样太厚；
2）相机原因；
3）手动调节 Gamma 可适当增加对比度-耗时；
4、视野中的杂质是什么：大白圆球，大梭形，小黑圆球，不明颗粒。
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