样本制备原则

1. 代表性原则
取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，应根据实验目的慎重选择取样方案。应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，保证实验结果的可信度。
2. 准确性原则
准确记录代表性样本的各种特征数据，按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。
3. 迅速性原则
样本质量影响实验结果的最关键因素，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。
4. 低温原则
所取样本离体后，应尽快置于干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免外泌体降解。

样本制备指南

1. 贴壁/悬浮细胞
1.1 细胞上清
1. 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液；
2. 加入适量的PBS 缓冲液冲洗一次，彻底去除FBS；
3. 按每10cm皿（约10⁷细胞）10ml培养基，换无血清替代培养基培养至少48hr（细胞融合率至少70%以上）；
4. 48hr后，收集细胞上清，并于3000×g离心15min，去除细胞或细胞碎片；
5. 放入-80℃冰箱中保存。
注意事项：
1、细胞生长正常。换无血清替代培养基（或无外泌体血清培养基）时的细胞密度与收培养上清时的细胞密度，一定要有显著增长，例如从60~70%长到90~95%。如细胞无显著增殖生长无须收样检测，因基本无多少外泌体分泌。避免细胞长得过满导致细胞凋亡，细胞凋亡可能降解外泌体
2、及时离心处理。收集细胞上清后第一时间离心去除细胞及细胞碎片，离心后的细胞上清再放入 -80℃冰箱保存，避免外泌体因细胞及细胞碎片存在而导致外泌体降解。
3、无血清替代培养基并非指的是DMEM、1640 此类基础培养基，而是可以正常维持细胞生长的无血清替代培养基。
2. 血液
外泌体血液样本提取时，请大家注意血清和血浆都可以正常提取。如果提供全血，是无法完成的，必须提前做好血清或者血浆的分离。以下是全血、血浆、血清的区别
1、全血：通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液。
2、血浆：经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。
3、血清：不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，在进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。
全血经过长时间放置，或通过冷冻、或高速离心后，会发生溶血，此时无法提取外泌体。所以，一定要提前做好血清或者血浆的分离，并且采血后尽快进行分离，期间不能经过冷冻，离心时转速不能太高，离心后取上清即可。

不同样本提取的外泌体对比图

具体血液样本操作如下:

采血时间一般为早晨或上午
1. 血浆：将抗凝管收集的全血2mL，迅速涡旋或用移液器Tip混匀；
2. 血清：收集不加抗凝剂的全血2mL，加入到离心管或促凝管中，凝血后进行下一步离心；

2. 在1小时（室温条件下）或2小时（4℃条件下）内进行下面的操作：4℃，1900g（1568rpm）离心10分钟；
3. 吸取约1mL上清转至洁净的1.5 mL 离心管中，16,000g (13,200rpm)，4℃，离心10分钟，小心吸取上清到新的离心管中；
4. 放入-80℃冰箱中保存；
5. 填写样本登记单，记录样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
3. 组织液
3.1 尿液
1. 收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液20ml，并注意避免细菌污染，收集前注意对饮食的控制；
2. 并于3000×g离心15min，去除细胞或细胞碎片；
3. -80℃冰箱中保存；
4. 填写样本登记单，记录样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
3.2 脑脊液
1. 收集集脑脊液10ml，避免受到血液污染；
2. 并于3000×g 离心15min，去除细胞或细胞碎片；
3. -80℃冰箱中保存；
4. 填写样本登记单，记录样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
4. 外泌体
1. 收集细胞上清或组织液10ml（血清1ml），抽提外泌体后，用100μL-500μLBuffer重悬沉淀（所用buffer 根据下游的蛋白分析则用蛋白裂解液， RNA分析则TriZol裂解）；
2. 检测浓度，蛋白浓度≥1ug/ul，RNA浓度≥50ng/ul；
3. 放入-80℃冰箱中保存。

样本包装注意事项

1. 在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。避免被乙醇等有机溶剂抹掉。

2. 请用铝箔或冷冻保存管包裹样本后再装入样本袋中，避免使用纱布、纸张直接包裹样本。

3. 标签纸请贴于样本袋绳上，避免贴于容器表面导致脱落造成样本混乱。
4. 请在填写《样本登记单》时应当详细描述样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员制定合理的实验方案。

样本储存——冷冻储存

1. 样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即到-80℃中保存。
2. 细胞上清样本处理后储存于-80℃冰箱中。在-20℃冰箱中储存不宜太久。
3. 血液样本建议使用PAXgene管（BD）保存。
4. RNA/蛋白样本储存于-80℃冰箱中。

样本运输

1. 干冰运输
1. 干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。
2. 干冰运输可委托当地快递公司，注意一定要确保48小时送达。
3. 24小时到达的，干冰数量不得低于5公斤；48小时到达的，干冰数量不得低于8公斤。夏季适当增加干冰（1.5 倍）。超过48小时到达的，建议不要用此法运输。
4. 运输时可在干冰上再放一排冰袋。

2. 冰袋运输
如能确保样本在24 小时内到达本公司的，以下几种类型样本可使用冰袋运输：
1. 保存于TRIzol或WB裂解液或PBS中的外泌体样本。
2. 用于抽提外泌体的新鲜的尿液、组织液样本。

注意事项

1. 所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。
2. 提取外泌体的得率：
2.1 处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的外泌体的量不同，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中外泌体的量可能与常规相应样本有显著的差异；
2.2 储存条件以及储存时间影响外泌体得率，一般来说从新鲜的样本中总是能够得到预期的外泌体产量，未保存在-80℃或-20℃冰箱中的非新鲜样本不可靠。保存在-80℃冰箱中的样本，如果储存时间过长，外泌体产量也会显著降低。因此，实验中样本需要量应以抽提结果为准。
3. 关于备份
3.1 为确保实验的顺利，建议取样时备份。
3.2 备份又分为两种，一种为严格备份，即：样本取下后一分为二，这样的两份样本基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样本，这样的备份样本同质性要较前者差。

样本量参照表

样本类型	所需样本参考量（体积）
样本类型	表征检测（电镜、粒径、Marker蛋白检测）	组学研究（NGS测序/蛋白质组）
细胞上清*	20 mL	50-60 mL
血清	1 mL	2 mL
血浆	1 mL	2 mL
尿液	20 mL	50-60 mL
脑脊液	10 mL	20-30 mL
腹水	10 mL	20-30 mL
羊水	10 mL	20-30 mL
乳液	5 mL	10-20 mL
精液	1 mL	2-4 mL
唾液	5 mL	10-20 mL
备注：
*细胞上清液：	指常见的肿瘤细胞，如HeLa、A549、HepG2等；然而神经细胞、干细胞分泌的外泌体量是肿瘤细胞的1/5~1/10左右，因此所需培养基上清量是肿瘤细胞的5-10倍。