IF=13.3 | Umibio细胞上清外泌体提取纯化试剂盒助力客户骨骼再生研究！

近期，来自重庆医科大学的李贤教授和涂小林教授团队在Theranostics杂志发表了题为“Engineered Dll4-overexpressing osteocyte-derived exosomes enhanced bone regeneration by regulating osteogenesis and angiogenesis”的科研论文，IF=13.3。

研究背景：

骨折愈合延迟常因骨细胞网络重建受损和血管形成不足所致，5%-10%的骨折会发生延迟愈合。传统手术治疗通常需要多次手术和延长恢复周期，干细胞疗法存在细胞存活率低、免疫排斥、畸形瘤形成等局限性。外泌体（30-200nm 细胞外囊泡）可传递蛋白、miRNA 等生物活性物质，是无细胞治疗的理想载体；然而天然外泌体在系统性给药时其靶向能力较差，其治疗效果可能受到限制。前期的研究证实过表达Dll4的骨细胞可通过Notch信号发挥促成骨/血管生成的双重作用，且骨细胞可通过旁分泌外泌体调控骨骼重塑。本文旨在研究Dll4 过表达骨细胞来源的外泌体（Dll4-Exo）协调骨质生成和血管生成双重效应以增强骨折愈合的具体机制。

研究成果及意义：

在本研究中，作者首先用慢病毒转染MLO-Y4骨细胞，构建了Dll4过表达骨细胞和GFP骨细胞（对照组），随后使用本公司的试剂盒对Dll4-EXO和GFP-EXO进行了分离纯化与鉴定，结果显示Dll4-EXO呈典型的茶托型结构，粒径大小为161.1nm，外泌体标志物CD81,HSP70，TSG101高表达，内质网标志物calnexin没有表达；免疫电镜和ELISA结果显示Dll4-EXO富含Dll4蛋白。为了研究外泌体能否被ST2细胞摄取，作者将DiD标记的Dll4-EXO和GFP-EXO与ST2细胞在条件培养基中培养12小时，并使用荧光显微镜实时监测外泌体的摄取,结果显示两种外泌体均能被ST2细胞高效摄取。随后作者进行了ALP染色、活性检测和qRT-PCR检测来确定成骨的最佳浓度，结果发现Dll4-Exo各浓度组ALP活性均显著高于对照组，且无剂量依赖性差异，50 μg/mL Dll4-Exo处理组成骨基因Alpl、Runx2、Osx表达均显著高于对照组。为了验证Dll4-Exo的成骨作用，作者进行了免疫荧光，Western blot和ARS染色实验，结果发现Dll4-Exo组ST2细胞中Alp、Osx、Runx2的蛋白表达水平显著高于对照组，钙沉积量较对照组增加了62%。这些结果表明Dll4-Exo显著促进ST2细胞成骨分化相关基因和蛋白表达，增强矿化能力。鉴于Notch信号传导是通过配体-受体结合和γ-分泌酶介导的NICD释放激活的，作者使用DAPT（γ-分泌酶抑制剂）来阻断该途径。结果发现缺乏DAPT时，Dll4-Exo组Notch靶基因Hes1、Hey1、HeyL表达显著高于对照组，DAPT处理后，该上调效应完全消失。ALP染色和WB实验表明，DAPT处理显著抑制Dll4-Exo诱导的ALP活性和成骨蛋白Alp、Osx、Runx2的表达。这些结果表明，Dll4-Exo主要通过Notch信号通路的激活介导成骨。为了研究Dll4-Exo的促血管生成作用，作者进行了划痕、Transwell 和管形成实验。细胞摄取实验结果显示Dll4-Exo可被HUVECs高效摄取，划痕实验结果显示24h后Dll4-Exo组HUVECs迁移率显著高于对照组，Transwell实验、管形成实验和qRT-PCR实验结果表明Dll4-Exo可显著促进HUVECs的迁移、管形成能力及血管生成相关基因(Angpt1、Hif1α和Vegf )的表达。为了评估Dll4-Exo的治疗效果，作者构建了胫骨骨折小鼠模型进行体内实验，X线成像结果显示Dll4-Exo组14天骨痂体积更大，骨折间隙更窄，21天实现牢固骨痂桥接，28天全部愈合，骨重塑更成熟，皮质更致密；HE和Masson染色结果显示，28天出现成熟板层骨和有序骨髓腔。CD31/α-SMA免疫荧光染色结果显示Dll4-Exo组血管密度提升1.56倍，且血管周细胞覆盖更完整，管腔更大，血管成熟度更高。表明局部注射Dll4-Exo可显著加速小鼠胫骨骨折愈合，同时提升骨折部位血管密度和成熟度。为了研究Dll4-Exo的潜在分子机制，作者进行miRNA测序，结果发现Dll4-Exo与GFP-Exo相比，13种miRNA上调，54种下调；上调最显著的5种miRNA分别是miR-23a-5p、miR-351-3p、miR-692、miR-335-3p、miR-741-3p。KEGG富集分析显示上调miRNA靶基因富集于Notch信号、轴突引导、血管生成等通路，GO富集分析显示miR-23a-5p靶基因富集于Notch信号、细胞分化、血管生成等功能模块。这些结果表明miR-23a-5p是Dll4-Exo中最核心的miRNA，且可被高效转运至ST2细胞和HUVECs。最后，作者做了miR-23a-5p在Dll4-Exo介导效应中的功能验证，结果发现ST2细胞转染miR-23a-5p mimic组成骨基因（Alpl、Runx2、Osx）和Notch靶基因（Hes1、Hey1）表达显著升高，抑制剂组显著降低。Transwell实验结果显示，HUVEC s转染miR-23a-5p mimic后，迁移能力无显著增强，抑制剂组显著降低。血管新生相关基因的qRT-PCR结果显示，HUVECs中miR-23a-5p mimic对Notch靶基因（Hes1、Hey1）和血管生成基因（Hif1α、E-cad、Vegf）表达无显著影响。这些结果表明miR-23a-5p是Dll4-Exo促进成骨分化的关键介质，但Dll4-Exo促血管生成作用不依赖miR-23a-5p，存在独立机制。

综上所述，作者成功构建了Dll4过表达骨细胞来源外泌体（Dll4-Exo），其可通过激活Notch信号通路协同促进成骨与血管生成，显著加速小鼠胫骨骨折愈合，其中miR-23a-5p是其促成骨的关键功能性miRNA，而促血管生成作用不依赖miR-23a-5p，存在独立机制。这项研究为骨细胞外泌体介导的骨-血管耦合提供了基础见解，并强调了工程化外泌体作为协同骨和血管修复平台的前景。

该研究中使用本公司的细胞上清外泌体提取纯化试剂盒（货号：UR52121）对Dll4过表达骨细胞来源外泌体（Dll4-Exo）和对照组（GFP-Exo）进行了提取纯化，结果符合各检测指标要求，满足了客户下游实验需求。

参考文献：

Engineered Dll4-overexpressing osteocyte-derived exosomes enhanced bone regeneration by regulating osteogenesis and angiogenesis.Theranostics.2026 Jan 1;16(6):2780-2797.

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